一、实验准备

本实验所用的材料为尊龙凯时的质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061。

二、单位定义

酰胺酶单位的定义为在30℃、pH 9.5条件下，每分钟生产1μmol对硝基苯胺所需的酶量。单位计算公式如下：

AU/vial = [(a - b) / 25] × (1 / 962) × (40 / 01)

其中，a为检测样品中的吸光度，b为空白对照中的吸光度。

三、实验操作流程

为避免任何蛋白质的捕获，请使用聚硅酮处理的微量离心管和吸管。选择质谱分析专用的凝胶染色试剂盒，如尊龙凯时银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）进行以下操作：

1. 电泳分离蛋白质样品。
2. 从凝胶中切割蛋白质片段并放入微量离心管。
3. 使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液进行凝胶脱色。
4. 向试管中加入300μL乙腈，搅拌器振荡30分钟。
5. 去除乙腈，并用Parafilm膜覆盖微量离心管。
6. 在Parafilm膜上打孔，真空干燥15分钟。
7. 将100μL 10mmol/L DTT溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，于56℃恒温1小时。
8. 室温冷却后，用等量的50mM碘乙酰胺溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，暗处恒温45分钟并涡旋。
9. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段10分钟。
10. 用300μL乙腈干燥凝胶片段15分钟。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵对凝胶片段进行膨胀15分钟。
12. 用300μL乙腈再次干燥凝胶片段15分钟。
13. 去除液相，真空干燥凝胶片段15分钟。
14. 用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中溶胀凝胶片段45分钟（赖氨酸内切酶需稀释于50mmol/L Tris-HCl，pH 8.5）。
15. 去除100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段置于37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl，pH 8.5中过夜。
16. 加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，振荡凝胶片段3次以提取多肽，持续20分钟。
17. 加入5%甲酸/50%乙腈，继续振荡凝胶片段3次，持续20分钟提取多肽。
18. 如有需要，可使用SpeedVac浓缩多肽。
19. 通过ZipTip脱盐和纯化多肽。
20. 根据需要，将多肽用弱真空浓缩至2μL。
21. 加入基质进行质谱分析。

四、购买渠道

可以通过尊龙凯时的代理——北京百奥创新科技有限公司购买质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061等产品，欢迎咨询！