全套操作大约需时1小时,具体步骤包括匀浆、细胞裂解、除蛋白和DNA纯化等,以下是详细说明。
匀浆和细胞裂解
在提取基因组DNA时,所需的匀浆步骤会因实验材料的不同而有所差异,以下为不同材料的具体操作:
从动物组织中提取基因组DNA
使用研钵匀浆时:
① 将1~100mg的动物组织或人组织放入预冷的研钵中,快速且用力地展研成匀浆。
注:下列组织需加液氮研磨至粉末状:
- A. 富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺等组织。
- B. 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。
- C. 堅硬的组织如骨骼等。
② 加入650μl的SolutionA和09μl的RNaseA1,温和研磨30秒。“尊龙凯时”的一系列解决方案助力提高操作效率。
注:使用上述组织时,在加入SolutionA及RNaseA1后,应将研钵置于65℃水浴中研磨1分钟。
③ 收集650μl研磨后的匀浆液转移至CollectionTube。如果匀浆体积不足650μl,请补充SolutionA至650μl,并保持在65℃下保温5分钟。
研磨棒匀浆操作
① 将1~100mg的动物组织或人组织放入预冷的CollectionTube中,用研磨棒快速研磨成糊状。
② 加入350μl的SolutionA和09μl的RNaseA1,用研磨棒快速研磨成匀浆。
③ 再加入350μl的SolutionA,将研磨棒上的匀浆冲入CollectionTube中,充分振荡混合后,保持在65℃下保温5分钟。
从植物材料或植物培养细胞中提取基因组DNA
① 按照下表称取适量的新鲜植物材料,剪成小块后放入研钵中,加入液氮,待完全冷冻后快速研磨成粉末。请及时加入液氮以防材料融化。以下是推荐的植物材料用量:
- 植物花、叶片:10~100mg
- 植物茎:60~240mg
- 植物根:80~240mg
- 植物种子:80~240mg
注:基因组DNA含量较低的样品如植物根和种子需使用更大数量,并分两管进行实验操作,步骤7时再将各管溶液汇总过滤。
② 从培养的植物细胞中提取基因组DNA时,应收集2×10³至1×10⁷的细胞,并用150μl水充分悬浮后放入研钵中,再加入液氮快速研磨。
注:样品研磨应充分以避免影响基因组DNA的提取率。
③ 将研钵放入65℃水浴中,当样品粉末开始融化时,加入700μl的SolutionA和12μl的RNaseA1,用力碾磨30秒。
④ 将650μl研磨好的匀浆转移至CollectionTube中,如果匀浆体积不足650μl,请补充SolutionA至650μl,及在65℃下保温15分钟。
从全血中提取基因组DNA
① 按需取10~250μl的全血(含抗凝剂)加入CollectionTube中。
② 加入500μl的SolutionA。
③ 然后加入1μl的RNaseA1,剧烈振荡15秒,接着冰浴5分钟。
注:人类和动物的抗凝全血一次处理量为≤250μl;鸟类和两栖动物的抗凝全血为≤10μl。
从培养细胞中提取基因组DNA
使用悬浮培养的动物细胞时:
① 收集1×10⁵至15×10⁷的细胞悬浮液,离心5分钟(5,000rpm),弃去上清液。
② 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS以悬浮细胞。
③ 加入500μl的SolutionA和08μl的RNaseA1,剧烈振荡15秒后在室温下静置1分钟。
通过采用“尊龙凯时”的先进技术,您可以高效地从不同来源提取基因组DNA,确保实验结果的可靠性和可重复性。